Are oxidative stress screening tests enough for small scale Quercus robur genetic monitoring?

Abstract

Although being present much widely in terms of its geographical distribution, pedunculate oak (Quercus robur L.) represents one of the crucial species in forest ecosystems in South Eastern Europe. We wanted to contribute to existing efforts in designing genetic monitoring methodology for this noble broadleaved species, through the screening of genotypes with different health status and belonging to two phenological varieties [early (var. praecox) vs late (var. tardissima)] using seven oxidative stress parameters (total protein content, total phenolic compounds content, total flavonoids content, DPPH, ABTS, NO radical scavenger activities and Ferric reducing antioxidant power essay - FRAP). Results of this study provided significant biological message, contributing to better understanding of existing biodiversity of pedunculate oak in Serbia. Four out of seven oxidative stress screening tests (total phenolic compounds content, total flavonoids content, RSC NO and FRAP) clearly discriminated late vs early individuals sampled from selected pedunculate oak gene pool. Although presented results did not show significancy in using mentioned parameters to distinct damaged from vital individuals, nevertheless, knowledge gained through discussion and comparison with previous studies contributed to precise determination of biochemical tests which might be used in future efforts of genetic monitoring of this species.

Prema klimatskim scenarijima RCP-a, hrast lužnjak (Q. robur L.) označen je kao najteže pogođena vrsta drveća zbog stalnih, intenzivnih klimatskih promjena. Propadanje hrastovih šuma može uzrokovati velike ekonomske gubitke, budući da se hrastovi smatraju vrlo vrijednim primjercima drveća zbog duge povijesti iskorištavanja za proizvodnju drva i gradnju (Mikac i sur., 2018.). Uzimajući u obzir da uobičajeni biokemijski parametri mogu doprinijeti razumijevanju temeljnih obrambenih mehanizama biljaka protiv stresa od suše i stoga se koristiti kao pouzdani deskriptori prilagodljivosti u kontekstu klimatskih promjena, cilj ove studije bio je utvrditi postoji li neki od 7 predloženih testova praćenja oksidacijskog stresa (ukupni sadržaji bjelančevina, fenola, flavonoida i testovi hvatači slobodnih radikala – ABTS, NO, FRAP i DPPH) koji može poslužiti za dugoročni genetski monitoring dviju sorti hrasta lužnjaka (rani vs kasni). Fenološki varijeteti [rani (var. praecox) vs kasni (var. tardissima)] i fiziološka skupina (vitalne ili oštećene) bile su promatrane varijable u testiranih jedinki zbirnog radnog hrasta vitalnog (PEOV), zbirnog ranog hrasta oštećenog (PEOD), zbirnog kasnog vitalnog (PLOV) i zbirnog ranog oštećenog (PLOD). Svaka objedinjena (zbirna) skupina sadržavala je ukupno 10 ili 11 uzoraka, mjerenih u tri primjerka kako bi se postigla optimalna statistička značajnost za svaku skupinu (za više, pogledajte pododjeljak Statistika). Sakupljeno lišće odmah je označeno i stavljeno u aluminijski folij, konzervirano na suhom ledu i transportirano u Laboratorij za kemijske i biokemijske analize Instituta za nizinsko šumarstvo i okoliš (ILFE) na daljnju obradu. Dva grama hrastovog lišća homogenizirano je u ohlađenom mužaru s tučkom s 10 ml fosfatnog pufera (0,1 M KH2PO4, pH=7), centrifugirano 10 min na 11000 okretaja u minuti i supernatant je korišten za daljnji test praćenja oksidativnog stresa (Tablica 1), prema uputama autora. Sve analize određene su spektrofotometrijski u mikropločicama s čitačem Multiplate MultiScan GO (Thermo Scientific, Njemačka). Dobiveni rezultati biokemijskih parametara pokazali su da je lišće kasnog hrasta imalo veći sadržaj bjelančevina i fenolnih spojeva od ranog, bez obzira na fiziološku skupinu (vitalno ili oštećeno) (Tablica 2). Štoviše, radi boljeg prikaza rezultata iz Tablice 2. prikazali smo ih grafički (Graf 1. i 2.). Najveći udio ukupnih flavonoida imali su listovi PLOD i PLOV, a najmanji listovi PEOV i PEOD (Tablica 2). Što se tiče ispitivanja kapaciteta hvatanja radikala, svi testirani listovi imali su nizak kapacitet hvatanja. ABTS- i NO- testovi hvatači radikala pokazali su manje od 50% hvatanja za sve uzorke, dok je DPPH-test pokazao neznatno više od 50% hvatanja za PEOD, PEOV, PLOV listove (56,15%, 57,28% odnosno 51,58%) i 41,69 % za listove PLOD. Kasno lišće hrasta ima veću antioksidacijsku moć reduciranja željeza (203,5 odnosno 180,4 mg TE/g FW) nego rano (93,9 odnosno 85,5 mg TE/g FW), bez obzira na fiziološku skupinu (Tablica 2). Razlike između ranih i kasnih genotipova hrasta bile su značajnije u pogledu ukupnog sadržaja fenola i flavonoida, kao i antioksidativne moći reduciranja željeza (FRAP). Ovo zapažanje također je potvrđeno PCA analizom, gdje su sva tri parametra grupirana zajedno s malom razlikom u najdominantnijoj komponenti PC1 (Graf 3). Dvosmjerna ANOVA u našem slučaju pokazala je da fiziološko grupiranje nije imalo utjecaja na ukupni sadržaj fenola i naknadno na aktivnost hvatača radikala FRAP, ABTS i NO. Dobiveni rezultati mogu pomoći da se objasne razlike u biokemijskim odgovorima na abiotičke stresove stabala hrasta lužnjaka na različitim mikrolokalitetima i na razini varijeteta unutar jednog šumskog kompleksa te nam mogu pružiti vrijedne informacije o varijabilnosti unutar vrste u otpornosti na sušu (rano naspram kasno). Stoga ovo može biti važan alat za poboljšanje strategija uzgoja i planova umjetne regeneracije hrasta lužnjaka u sušnijim nizinskim regijama. S obzirom na rezultate, potrebno je dugoročno mjerenje parametara oksidacijskog stresa stabala hrasta na individualnoj i populacijskoj razini, kako bi se dobila jasnija slika o tome kakve se promjene događaju na molekularnoj razini. Ova mjerenja također mogu biti korisna u genetskom praćenju stabala hrasta postavljenih u polukontroliranim i kontroliranim uvjetima. Na taj način bi se mogao dobiti uvid u točan genetski kapacitet vrsta drveća u pogledu njihove otpornosti na abiotski stres na pojedinim mikrolokalitetima unutar krajolika.